Сайт для врачей о
клинической лабораторной диагностике
Цитохимическое исследование миелопероксидазы
Миелопероксидаза является лизосомальным ферментом, катализирующим в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. Она локализуется преимущественно в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и является маркером клеток миелоидного ряда. Миелопероксидаза выявляется в клетках гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта. Активность фермента повышается по мере созревания клеток. В сегментоядерных нейтрофилах здоровых людей выявляется высокая активность миелопероксидазы в виде гранул, заполняющих цитоплазму.
Самая высокая активность фермента наблюдается в зрелых эозинофилах. В базофильных промиелоцитах и миелоцитах активность миелопероксидазы, как правило, высокая. Однако, по мере дифференцировки их в зрелые клетки, активность фермента снижается. Зрелые базофилы могут быть почти отрицательными по данному признаку. Слабоположительная реакция на миелопероксидазу наблюдается в различном проценте моноцитов в виде немногочисленных рассеянных гранул. В эритрокариоцитах, лимфоцитах и мегакариоцитах миелопероксидаза не определяется.
В клетках миелопероксидаза участвует в реакциях разрушения токсичной перекиси водорода. В цитохимических реакциях активность фермента определяется по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и других) по методу Грэхема–Кнолля или его модификаций.
Метод Грэхема-Кнолля
Принцип метода: В присутствии миелопероксидазы бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин.
Посуда
- Химические стаканы.
- Мерные цилиндры.
- Пипетки.
Реактивы:
- 4% формалиново-спиртовой раствор (10 частей 40% формалина и 90 частей 96% спирта).
- Пероксидазный реактив: бензидин (на кончике ножа) растворяют в 6 мл 96% спирта, прибавляют 4 мл воды и 0,02 мл 3% перекиси водорода. Реактив годен к употреблению в течение 5 — 6 дней.
- Краситель Романовского-Гимзы.
Ход окраски:
- Свежие мазки (1-2-дневной давности) фиксируют 4% формалиново-спиртовым раствором в течение 30 секунд.
- Обмывают в проточной воде и высушивают.
- Заливают пероксидазным реактивом на 5 минут.
- Тщательно промывают в проточной воде и высушивают.
- Докрашивают красителем Романовского-Гимзы.
- Миелопероксидаза выявляется в цитоплазме клеток в виде коричневых гранул.
Модифицированный метод Нарциссова Р. П.
Принцип: В присутствии пероксидазы бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин. Для уменьшения инактивации фермента использованы соответствующий фиксатор и небольшое количество перекиси водорода.
Реактивы
- 60% водный раствор ацетона.
- 0,1 M раствор бората натрия (можно использовать фосфатный или мединаловый буферный раствор pH 7,6).
- Инкубационная среда: 5 мл 5% водного раствора трилона Б, 10 мл раствора бората натрия, 35 мл насыщенного раствора бензидина и 2 мл 0,003% раствора перекиси водорода (готовят из 3% раствора разведением в два этапа перед употреблением).
- 0,5% раствор метилового зеленого на буферном растворе (pH 5,0) или 0,1% водный раствор метиленового синего.
Ход окраски
- Свежеприготовленные мазки фиксируют в 60% водном растворе ацетона в течение 30 секунд.
- Промывают дистиллированной водой.
- Инкубируют в инкубационной среде в течение 1 часа в термостате при 37 °C.
- Промывают дистиллированной водой.
- Докрашивают мазки метиловым зеленым или метиленовым синим в течение 10 минут.
Модифицированный метод Шафран М. Г. и соавторов
Принцип: окисление О-дианизидина перекисью водорода в присутствии миелопероксидазы.
Реактивы
- 10% спиртовой раствор формалина (1 мл 10% формалина и 9 мл этилового спирта).
- Спиртовой раствор О-дианизидина: 24 мг О-дианизидина растворяют в 5 мл метанола и доводят дистиллированной водой до 9,9 мл.
- 3% раствор перекиси водорода.
- Реакционная смесь: к спиртовому раствору О-дианизидина прибавляют перед употреблением 0,1 мл перекиси водорода.
- 0,25% водный раствор азура А или другой ядерный краситель.
Ход окраски
- Мазки фиксируют спиртовым раствором формалина в течение 10 - 15 секунд.
- Споласкивают проточной водой.
- На мазки наносят реакционную смесь на 2 — 3 мин при комнатной температуре.
- Споласкивают проточной водой.
- Докрашивают раствором азура в течение 10 — 15 секунд.
- Споласкивают проточной водой и высушивают.
Нормальные величины активности миелопероксидазы
В крови здоровых людей 3 — 16% нейтрофилов имеют резко положительную, 60 — 90% - умеренно положительную, остальные — слабо положительную реакцию на миелопероксидазу. СЦК нейтрофилов здоровых людей равен 2,23 — 2,89. У детей в возрасте 7 лет СЦК составляет 2,03 — 2,11, к периоду полового созревания увеличивается у мальчиков до 2,163 — 2,237, а у девочек уменьшается до 1,949 — 2,011, к 15 годам половые различия выравниваются.
Клиническое значение активности миелопероксидазы
Реакция используется главным образом с целью диагностики острых лейкозов. При острых миелобластных лейкозах активность миелопероксидазы в опухолевых клетках варьирует от слабой до выраженной в зависимости от степени дифференцировки бластов. Так, при остром миелобластном лейкозе с низкой степенью дифференцировки бластов (M1 по ФАБ-классификации), количество пероксидазоположительных бластов невелико (не превышает 10%), степень активности фермента в них невысокая. Тогда как при остром промиелоцитарном лейкозе (M3 по ФАБ-классификации) миелопероксидаза выявляется практически в 100% бластных клеток, причем активность ее равнозначна таковой в зрелых нейтрофилах. Однако отсутствие точных количественных способов оценки цитохимических реакций не позволяет использовать их для верификации степени дифференцировки бластных клеток, а следовательно, и более тонкой дифференциальной диагностики острых лейкозов. Таким образом, с помощью цитохимических реакций определяют линейную направленность, а не степень дифференцировки бластов.
При острых монобластных лейкозах реакция на миелопероксидазу в опухолевых клетках слабая, при острых лимфобластных лейкозах — отрицательная.
Снижение активности фермента в нейтрофилах обнаружено при инфаркте миокарда, ревматизме, туберкулезе, опухолях. У больных хроническим миелолейкозом, особенно в терминальной стадии, СЦК снижается до 1,44 — 1,82.
Микрофотографии (миелопероксидаза)
Peroxidase reaction
Peroxidase reaction
Литература:
- Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е. А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.
- Справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В. В. Меньшикова Москва "Медицина" 1987 г.
- В.Г. Палагнюк - Цитохимическая диагностика острых лейкозов
Новые статьи
2 января, 2013
Мочевая кислота. Неорганизованные осадки мочи.
Обычно мочевая кислота в моче микроскопически определяется в виде желтых, желто-зеленых и бурых или буро-фиолетовых кристаллов. Макроскопически же наличие большого количества мочевой кислоты определяется в виде буро-желтого или золотисто-желтого песка...
Раздел: Анализ мочи
15 мая, 2012
Неорганизованные осадки мочи
Неорганизованные осадки мочи состоят из различных солей, органических соединений и лекарственных веществ, осевших в моче в виде кристаллов или аморфных тел. Однако чаще неорганизованный осадок состоит преимущественно из солей...
Раздел: Анализ мочи
22 марта, 2012
Микроскопическое исследование осадка мочи
Микроскопическое исследование осадка мочи является неотъемлемой частью общеклинического исследования и часто служит основным методом диагностики заболеваний почек и мочевыводящих путей...
Раздел: Анализ мочи
5 июня, 2011
Глюкоза в моче. Клинико-диагностическое значение глюкозурии.
Появление глюкозы в моче называется глюкозурией. Глюкозурия обычно сопровождается полиурией при повышении осмолярности мочи, поскольку глюкоза - осмотически активное вещество. Между степенью глюкозурии и полиурии обычно наблюдается параллелизм...
Раздел: Анализ мочи
21 июля, 2010
Кетоновые тела в моче. Методы определения.
Принцип обнаружения кетоновых тел в моче. Нитропруссид натрия в щелочной среде реагирует с кетоновыми телами, образуя комплекс, окрашенный в розовато-сиреневый, сиреневый или фиолетовый цвет. Чувствительность проб около 50 мг/л кетоновых тел. Полуколичественную оценку результатов можно дать в интервале от 150 до 1500 мг/л...
Раздел: Анализ мочи