Цитохимическое исследование миелопероксидазы

Миелопероксидаза является лизосомальным ферментом, катализирующим в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. Она локализуется преимущественно в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и является маркером клеток миелоидного ряда. Миелопероксидаза выявляется в клетках гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта. Активность фермента повышается по мере созревания клеток. В сегментоядерных нейтрофилах здоровых людей выявляется высокая активность миелопероксидазы в виде гранул, заполняющих цитоплазму.

Самая высокая активность фермента наблюдается в зрелых эозинофилах. В базофильных промиелоцитах и миелоцитах активность миелопероксидазы, как правило, высокая. Однако, по мере дифференцировки их в зрелые клетки, активность фермента снижается. Зрелые базофилы могут быть почти отрицательными по данному признаку. Слабоположительная реакция на миелопероксидазу наблюдается в различном проценте моноцитов в виде немногочисленных рассеянных гранул. В эритрокариоцитах, лимфоцитах и мегакариоцитах миелопероксидаза не определяется.

В клетках миелопероксидаза участвует в реакциях разрушения токсичной перекиси водорода. В цитохимических реакциях активность фермента определяется по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и других) по методу Грэхема–Кнолля или его модификаций.

Метод Грэхема-Кнолля

Принцип метода: В присутствии миелопероксидазы бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин.

Посуда

• Химические стаканы.
• Мерные цилиндры.
• Пипетки.

Реактивы:

• 4% формалиново-спиртовой раствор (10 частей 40% формалина и 90 частей 96% спирта).
• Пероксидазный реактив: бензидин (на кончике ножа) растворяют в 6 мл 96% спирта, прибавляют 4 мл воды и 0,02 мл 3% перекиси водорода. Реактив годен к употреблению в течение 5 — 6 дней.
• Краситель Романовского-Гимзы.

Ход окраски:

• Свежие мазки (1-2-дневной давности) фиксируют 4% формалиново-спиртовым раствором в течение 30 секунд.
• Обмывают в проточной воде и высушивают.
• Заливают пероксидазным реактивом на 5 минут.
• Тщательно промывают в проточной воде и высушивают.
• Докрашивают красителем Романовского-Гимзы.
• Миелопероксидаза выявляется в цитоплазме клеток в виде коричневых гранул.

Модифицированный метод Нарциссова Р. П.

Принцип: В присутствии пероксидазы бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин. Для уменьшения инактивации фермента использованы соответствующий фиксатор и небольшое количество перекиси водорода.

Реактивы

• 60% водный раствор ацетона.
• 0,1 M раствор бората натрия (можно использовать фосфатный или мединаловый буферный раствор pH 7,6).
• Инкубационная среда: 5 мл 5% водного раствора трилона Б, 10 мл раствора бората натрия, 35 мл насыщенного раствора бензидина и 2 мл 0,003% раствора перекиси водорода (готовят из 3% раствора разведением в два этапа перед употреблением).
• 0,5% раствор метилового зеленого на буферном растворе (pH 5,0) или 0,1% водный раствор метиленового синего.

Ход окраски

• Свежеприготовленные мазки фиксируют в 60% водном растворе ацетона в течение 30 секунд.
• Промывают дистиллированной водой.
• Инкубируют в инкубационной среде в течение 1 часа в термостате при 37 °C.
• Промывают дистиллированной водой.
• Докрашивают мазки метиловым зеленым или метиленовым синим в течение 10 минут.

Модифицированный метод Шафран М. Г. и соавторов

Принцип: окисление О-дианизидина перекисью водорода в присутствии миелопероксидазы.

Реактивы

• 10% спиртовой раствор формалина (1 мл 10% формалина и 9 мл этилового спирта).
• Спиртовой раствор О-дианизидина: 24 мг О-дианизидина растворяют в 5 мл метанола и доводят дистиллированной водой до 9,9 мл.
• 3% раствор перекиси водорода.
• Реакционная смесь: к спиртовому раствору О-дианизидина прибавляют перед употреблением 0,1 мл перекиси водорода.
• 0,25% водный раствор азура А или другой ядерный краситель.

Ход окраски

• Мазки фиксируют спиртовым раствором формалина в течение 10 - 15 секунд.
• Споласкивают проточной водой.
• На мазки наносят реакционную смесь на 2 — 3 мин при комнатной температуре.
• Споласкивают проточной водой.
• Докрашивают раствором азура в течение 10 — 15 секунд.
• Споласкивают проточной водой и высушивают.

Нормальные величины активности миелопероксидазы

В крови здоровых людей 3 — 16% нейтрофилов имеют резко положительную, 60 — 90% - умеренно положительную, остальные — слабо положительную реакцию на миелопероксидазу. СЦК нейтрофилов здоровых людей равен 2,23 — 2,89. У детей в возрасте 7 лет СЦК составляет 2,03 — 2,11, к периоду полового созревания увеличивается у мальчиков до 2,163 — 2,237, а у девочек уменьшается до 1,949 — 2,011, к 15 годам половые различия выравниваются.

Клиническое значение активности миелопероксидазы

Реакция используется главным образом с целью диагностики острых лейкозов. При острых миелобластных лейкозах активность миелопероксидазы в опухолевых клетках варьирует от слабой до выраженной в зависимости от степени дифференцировки бластов. Так, при остром миелобластном лейкозе с низкой степенью дифференцировки бластов (M1 по ФАБ-классификации), количество пероксидазоположительных бластов невелико (не превышает 10%), степень активности фермента в них невысокая. Тогда как при остром промиелоцитарном лейкозе (M3 по ФАБ-классификации) миелопероксидаза выявляется практически в 100% бластных клеток, причем активность ее равнозначна таковой в зрелых нейтрофилах. Однако отсутствие точных количественных способов оценки цитохимических реакций не позволяет использовать их для верификации степени дифференцировки бластных клеток, а следовательно, и более тонкой дифференциальной диагностики острых лейкозов. Таким образом, с помощью цитохимических реакций определяют линейную направленность, а не степень дифференцировки бластов.

При острых монобластных лейкозах реакция на миелопероксидазу в опухолевых клетках слабая, при острых лимфобластных лейкозах — отрицательная.

Снижение активности фермента в нейтрофилах обнаружено при инфаркте миокарда, ревматизме, туберкулезе, опухолях. У больных хроническим миелолейкозом, особенно в терминальной стадии, СЦК снижается до 1,44 — 1,82.

Микрофотографии (миелопероксидаза)

Peroxidase reaction
Peroxidase reaction

Литература:

• Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е. А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.
• Справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В. В. Меньшикова Москва "Медицина" 1987 г.
• В.Г. Палагнюк - Цитохимическая диагностика острых лейкозов