Цитохимическое исследование липидов

Липиды локализуются в цитоплазме клеток главным образом в мембранах органелл и обнаруживаются преимущественно в нейтрофильных гранулоцитах. Играют важную роль в проницаемости мембран. Цитохимическое исследование липидов основано на применении красящих веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет. Липоиды выявляются лучше суданом черным (черное окрашивание).

Окраска суданом III (метод Гольдмана)

Растворение жиров и окраска суданом III в оранжевый цвет.

Посуда и оборудование

• химические стаканы или кюветы
• мерные цилиндры
• пипетки
• воронки
• горелка

Реактивы

• Формалиновый спирт (1 часть формалина и 4 части 96% спирта)
• 70% этиловый спирт (к 100 мл 96 % спирта прибавить 39,18 мл дистиллированной воды)
• Альфа-нафтол
• Раствор судана (к 100 мл 70 % спирта добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1,2 г альфа-нафтола и в избытке судан III. Раствор кипятят в течение 10 мин и фильтруют)
• Краситель Романовского-Гимзы

Ход окраски

• Мазки крови фиксируют в формалиновом спирте в течение 1-3 мин.
• Красят в растворе судана III в течение 10 мин.
• Помещают в 70% этиловый спирт на 1 мин. Докрашивают красителем Романовского-Гимзы или гематоксилином в течение 5 - 10 мин.
• Промывают дистиллированной водой.
• Липиды выявляются в виде оранжевых зерен.

Окраска суданом черным. Метод Шихана, Стори.

Реактивы

• Раствор судана черного В. Растворяют 0,3 г судана в 100 мл абсолютного спирта. Оставить при комнатной температуре на 1 - 2 дня до полного растворения.
• Буферный раствор: а) 16 г кристаллически чистой карболовой кислоты растворяют в 30 мл абсолютного спирта; б) 0,3 г двузамещенного фосфата натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Растворы "а" и "б" смешать. Перед употреблением готовят забуференный раствор судана, смешивая 60 мл раствора судана и 40 мл буферного раствора.
• 0,2% раствор однозамещенного фосфата калия.
• Краситель Романовского-Гимзы.
• 70% этиловый спирт (к 100 мл 96% спирта прибавить 39,18 мл дистиллированной воды).

Ход окраски

• Мазки фиксируют в парах формалина 10 мин.
• Погружают в буферный раствор судана на 30 мин.
• Промывают несколько раз в 70% этиловом спирте.
• Окрашивают красителем Романовского-Гимзы 30 мин.

Нормальные величины (обе реакции)

В мазках периферической крови липиды содержатся в цитоплазме нейтрофилов в виде обильной зернистости. Большинство нейтрофилов (69 - 80%) у здоровых людей красятся интенсивно (+++), 18-36% дают окраску средней интенсивности (++) и 10% слабо окрашены (+). Средний цитохимический коэффициент (СЦК) липидов в нейтрофилах 2,617 - 2,683. В мазках костного мозга в миелобластах обнаружено небольшое содержание липидов, в промиелоцитах их больше и по мере созревания нейтрофилов содержание липидов увеличивается. В моноцитах и их предшественниках часто содержится различное число мелких или умеренно крупных гранул, распределенных по всей клетке, с некоторой тенденцией к концентрированию в перинуклеарной зоне или ободке цитоплазмы. Эритрокариоциты, ретикулоциты и зрелые эритроциты не содержат суданофильных гранул. В клетках лимфоидного ряда липиды не выявляются.

Клиническое значение

Отмечено повышение СЦК липидов у лиц старческого возраста. Повышение содержания липидов в нейтрофилах наблюдается при острых лейкозах и обострении хронических лейкозов. При острых лейкозах липиды в бластных клетках обнаружены у больных при миелобластном и монобластном вариантах и не выявлены при лимфобластном остром лейкозе. При недифференцированном остром лейкозе бластные клетки лишь в небольшом количестве (1,38 - 3,02%) содержат липиды.

Уменьшение липидов в нейтрофилах выявлено при ревматизме, воспалительных процессах, лечебном голодании.

Микрофотографии (липиды):

Sudan black B stain showing localised positivity and Auer rods in the blasts, and stronger positivity in the dysplastic metamyelocytes.
Липиды
Sudan black B stain. Typical heavy positivity filling the cytoplasm.

Литература:

• Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е. А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.
• Справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В. В. Меньшикова Москва "Медицина" 1987 г.
• В.Г. Палагнюк - Цитохимическая диагностика острых лейкозов