Сайт для врачей о
клинической лабораторной диагностике
Цитохимическое исследование гликогена
Метод Шабадаша
Под влиянием перйодата калия гликоген окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание, по интенсивности которого можно судить о количестве гликогена в клетках.
Посуда и оборудование
- Химические стаканы емкостью 50 мл или кюветы.
- Мерные цилиндры.
- Градуированные пипетки.
- Колбы емкостью 250 мл.
- Воронки.
- Горелки.
- Термостат.
- Весы.
Реактивы
- 0,03 М раствор перйодата калия или натрия: 230 мг перйодата растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Готовят перед употреблением.
- Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл кипящей дистиллированной воды. По мере охлаждения в раствор добавляют 1 г метабисульфита калия и 20 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Оставляют на сутки. Для полного обесцвечивания добавляют растолченную таблетку карболена, оставляют на сутки, затем фильтруют. Реактив сохраняют в темноте (лучше на холоде) в плотно закрытой посуде. Годен к употреблению в течение нескольких месяцев (легкая степень покраснения свидетельствует о непригодности реактива).
- Сернистая вода: к 10 мл 10 % раствора метабисульфита калия добавляют 200 мл дистиллированной воды и 10 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Готовят перед употреблением.
- Реактив Шабадаша: к 100 мл этилового спирта добавляют 1,8 г нитрата меди, 0,9 г нитрата кальция и 10 мл формалина.
- 1 н. раствор соляной кислоты (82,5 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19 доливают дистиллированной водой до 1 л).
- 0,1 % спиртовой раствор светло-зеленой краски (лихтгрюн).
Ход окраски
- Препараты фиксируют (тотчас после приготовления) в жидкости Шабадаша в течение 30 мин.
- Промывают в двух сменах дистиллированной воды.
- Погружают в раствор перйодата на 20 мин (в темноте).
- Промывают в трех сменах дистиллированной воды.
- Ополаскивают в сернистой воде (в течение 1 - 2 мин).
- Окрашивают реактивом Шиффа в течение 30 - 40 мин (в темноте).
- Промывают в трех сменах сернистой воды по 3 мин.
- Промывают в трех сменах дистиллированной воды по 3 мин.
- Окрашивают светло-зеленой краской в течение 10-20 с.
- Промывают в дистиллированной воде.
Для проведения реакции удобно все растворы поместить в химические стаканчики или кюветы и переносить препараты в указанной выше последовательности.
В настоящее время существуют реагенты для цитохимического исследования на гликоген заводского производства, которые более просты в применении. К сожалению, не все из них обладают хорошим качеством.
Результат метода Шабадаша
Гликоген окрашивается в вишнево-фиолетовый цвет на зеленом фоне препарата.
Расчет количества гликогена производят по полуколичественному методу или выражают в процентах.
Кроме гликогена, положительную реакцию могут давать такие ШИК-положительные вещества, как кислые и нейтральные мукополисахариды, мукопротеины, гликопротеины и др. Гликоген легко дифференцировать от других веществ пробой со слюной или диастазой.
Проба со слюной.
Препарат помещают в свежесобранную слюну и оставляют на 30 мин в термостате. Затем производят окраску на гликоген приведенным выше методом. Инкубация препаратов со слюной способствует расщеплению гликогена, и при реакции с реактивом Шиффа не получается розовой окраски.
Идентифицировать гликоген можно также путем предварительной инкубации мазков с амилазой (1 мл профильтрованной амилазы растворить в 40 мл физиологического раствора) в течение 30 мин в термостате.
На практике проба со слюной обычно не проводится, поэтому под PAS-положительным материалом понимаются, как правило, все полисахариды, а не только гликоген.
Нормальные величины метода Шабадаша
В мазках периферической крови гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов (в виде обильной мелкой зернистости), цитоплазме лимфоцитов (в виде небольшого количества крупных зерен) и тромбоцитах (в виде одиночных крупных зерен). В пунктате костного мозга гликоген выявляется в нейтрофилах разной степени зрелости, лимфоцитах и мегакариоцитах.
Концентрация PAS-положительного материала в клетках гранулоцитопоэза нарастает по мере созревания клеток. Диффузное окрашивание цитоплазмы обычно свойственно наиболее молодым клеткам гранулоцитарного ряда (миелобласты, промиелоциты, миелоциты). В зрелых нейтрофилах содержится много PAS-положительного вещества в виде мелких гранул, упакованных так плотно, что цитоплазматический фон плохо различим. У здоровых людей количество интенсивно окрашенных нейтрофилов крови (+++) колеблется в пределах 2—12 %, средней интенсивности окраски (++) - в пределах 72—90%, слабо окрашенных (+) — от 4 до 18%. СЦК равен 1,71—2,04. Некоторые авторы приводят более высокие значения СЦК гликогена в нейтрофилах здоровых людей (2,485 - 2,555). У лиц пожилого и старческого возраста отмечено достоверное снижение СЦК гликогена (1,93 - 2,03).
В зрелых эозинофилах и базофилах PAS-положительный материал располагается следующим образом: специфические гранулы остаются неокрашенными и резко выделяются на фоне диффузного окрашивания цитоплазмы.
В моноцитах гликоген чаще выявляется в виде мелкой пылевидной зернистости на фоне светло-розового диффузного окрашивания.
В лимфоцитах крови здоровых людей гликоген содержится в виде небольшого числа гранул в 8,1 - 12,7% клеток. Некоторые авторы дают цифры от 2 до 30%.
В норме от 3 до 10% клеток эритроидного ряда содержат мукополисахариды.
В мегакариоцитах костного мозга гликоген обнаруживается в виде гранул (от единичных до 30—50), напоминая скопления кровяных пластинок. У здоровых людей число гликогенположительных мегакариоцитов составляет 58,45 - 65,55 %. В тромбоцитах PAS-положительный материал выявляется в виде мелких рассеянных гранул по периферии клетки либо в виде интенсивного центрально расположенного пятна.
Клиническое значение метода Шабадаша
Увеличение содержания гликогена в нейтрофилах наблюдается при различных воспалительных процессах, эритремии, сахарном диабете, уменьшение - при агранулоцитозах, лучевой болезни, хроническом миелолейкозе, особенно при прогрессировании процесса.
Повышение числа гликогенположительных лимфоцитов (до 70 - 80 %) характерно для лимфопролиферативных заболеваний, особенно хронического лимфолейкоза.
При хроническом миелолейкозе содержание гликогена в гранулоцитах уменьшается приблизительно в 2 раза по отношению к норме, хотя общее его количество, определяемое биохимическими методами, может быть даже повышенным вследствие лейкоцитоза.
При тромбоцитопенической пурпуре и симптоматических тромбоцитопениях число гликогенположительных форм мегакариоцитов значительно снижено, после спленэктомии оно повышается до нормальных величин.
При острых лейкозах гликоген можно обнаружить в бластных клетках: при остром миелобластном лейкозе в виде мелкой зернистости в цитоплазме или в виде слабого диффузного ее окрашивания, причем в части бластов PAS-реакция отрицательная. При остром промиелоцитарном лейкозе наблюдается яркое диффузное окрашивание цитоплазмы. В монобластах реакция может быть отрицательной, слабо положительной в диффузной или диффузно-гранулярной форме (когда продукт реакции выявляется в виде рассеянных мелких или средних гранул, располагающихся по краю цитоплазмы, на диффузном фоне). При эритромиелозе гликоген в виде гранул обнаруживается в эритробластах, в виде диффузного окрашивания разной интенсивности - в нормобластах. Лимфобласты содержат гликоген в цитоплазме в виде средних и крупных гранул, располагающихся венчиком вокруг ядра, иногда сливающихся в блоки, на неокрашенном фоне. Количество клеток с таким характером PAS-реакции сильно варьирует при различных случаях острого лимфобластного лейкоза.
Цитохимическое исследование на гликоген можно проводить не только в мазках крови и костного мозга. Так, например, можно исследовать мазки влагалищного эпителия и по результатам исследования судить о функциональном состоянии яичников. В норме у женщин обнаруживают много гликогена в клетках, в то время как обеднение их гликогеном свидетельствует о нарушении функции яичников.
В опухолях количество гликогена различно: зрелые доброкачественные опухоли содержат много гликогена, в незрелых раковых опухолях количество гликогена резко уменьшено. Снижение гликогена в опухолевых клетках, вероятно, может быть использовано как показатель злокачественности опухоли.
Микрофотографии ШИК-реакции:
Neutrophils, PAS stain, ds, ds18, ds19, bd
Platelet , Mature Neutrophil, (PAS) stain
Late neutrophil, platelet, PAS stain, M-7 leukemia
Литература:
- Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е. А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.
- Справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В. В. Меньшикова Москва "Медицина" 1987 г.
- Л. В. Козловская, А. Ю. Николаев. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования. Москва, Медицина, 1985 г.
- В.Г. Палагнюк - Цитохимическая диагностика острых лейкозов
- Исследование системы крови в клинической практике. Под ред. Г. И. Козинца и В. А. Макарова. - М.: Триада-Х, 1997 г.
Новые статьи
2 января, 2013
Мочевая кислота. Неорганизованные осадки мочи.
Обычно мочевая кислота в моче микроскопически определяется в виде желтых, желто-зеленых и бурых или буро-фиолетовых кристаллов. Макроскопически же наличие большого количества мочевой кислоты определяется в виде буро-желтого или золотисто-желтого песка...
Раздел: Анализ мочи
15 мая, 2012
Неорганизованные осадки мочи
Неорганизованные осадки мочи состоят из различных солей, органических соединений и лекарственных веществ, осевших в моче в виде кристаллов или аморфных тел. Однако чаще неорганизованный осадок состоит преимущественно из солей...
Раздел: Анализ мочи
22 марта, 2012
Микроскопическое исследование осадка мочи
Микроскопическое исследование осадка мочи является неотъемлемой частью общеклинического исследования и часто служит основным методом диагностики заболеваний почек и мочевыводящих путей...
Раздел: Анализ мочи
5 июня, 2011
Глюкоза в моче. Клинико-диагностическое значение глюкозурии.
Появление глюкозы в моче называется глюкозурией. Глюкозурия обычно сопровождается полиурией при повышении осмолярности мочи, поскольку глюкоза - осмотически активное вещество. Между степенью глюкозурии и полиурии обычно наблюдается параллелизм...
Раздел: Анализ мочи
21 июля, 2010
Кетоновые тела в моче. Методы определения.
Принцип обнаружения кетоновых тел в моче. Нитропруссид натрия в щелочной среде реагирует с кетоновыми телами, образуя комплекс, окрашенный в розовато-сиреневый, сиреневый или фиолетовый цвет. Чувствительность проб около 50 мг/л кетоновых тел. Полуколичественную оценку результатов можно дать в интервале от 150 до 1500 мг/л...
Раздел: Анализ мочи