Ферментативные (уреазные) методы определения мочевины

Ферментативные методы определения мочевины приобрели наибольшее распространение в современной клинико-лабораторной практике. Эти методы определения мочевины называются также уреазными, так как в них в качестве реактива используется фермент уреаза. Для уреазы мочевина является единственным физиологическим субстратом, поэтому уреазные методы высокоспецифичны.

При сборе материала для исследования следует помнить, что фторид ингибирует уреазную реакцию. В связи с этим методы, основанные на использовании уреазы, не могут использовать образцы крови с добавлением фторида. Кроме того, для уреазных методов не может использоваться в качестве антикоагулянта аммониевая соль гепарина.

Ферментативные методы определения мочевины достаточно многочисленны, но все состоят из двух этапов. Первый этап - общий для всех уреазных методов. Суть его заключается в том, что под действием уреазы происходит гидролиз мочевины до аммиака. На втором этапе определяется концентрация аммиака, образовавшегося на первом этапе. В зависимости от используемых способов регистрации концентрации аммиака, ферментативные (уреазные) методы определения мочевины можно разделить на следующие группы:

• колориметрические по конечной точке,
• методы с использованием сопряженных ферментативных реакций,
• потенциометрические,
• методы с использованием технологии «сухой химии».

Ферментативные колориметрические методы определения мочевины по конечной точке

В данной группе методов на втором этапе аммиак взаимодействует с хромогенным комплексом с образованием окрашенного соединения, которое фотометрируют при длине волны 580 — 600 нм. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации мочевины в исследуемом материале.

К данной группе методов относятся:

• фенолгипохлоритный метод,
• салицилатгипохлоритный метод.

При фенолгипохлоритном методе аммиак на втором этапе реагирует с фенолом и гипохлоритом натрия, в результате чего образуется продукт синего цвета (индофенол). В случае салицилатгипохлоритного метода вместо фенола используется салицилат, а окрашенный продукт имеет зеленое окрашивание.

Уреазные методы определения мочевины с использованием сопряженных ферментативных реакций

При этих методах определения мочевины уровень аммиака на втором этапе определяют с использованием сочетанных ферментативных реакций.

Наиболее популярный метод определения мочевины в сыворотке крови или моче основан на использовании в качестве индикаторного фермента глутаматдегидрогеназы. При этом на втором этапе происходит преобразование выделяющегося аммиака (ионов аммония) в L-глутамат путем взаимодействия с 2-оксоглутаратом, катализируемого ферментом глутаматдегидрогеназой. Поскольку вторая реакция сопряжена с окислением НАД·Н до НАД+, результаты реакции регистрируют по убыванию оптической плотности раствора при 340 нм. Существуют и некоторые модификации этого метода (используют альфа-кетоглутарат и получают L-глутаминат и др.), но конечный принцип регистрации результатов окисления НАД·Н включен во все указанные методы. Следует отметить, что многие ферменты, содержащиеся в сыворотке крови, способны конкурировать с глутаматдегидрогеназой за кофермент НАДН₂ и вмешиваться в результаты исследования. Кроме того, аммиак, который может содержаться в составе реактивов, может приводить к ложному завышению результатов. Реакция при использовании сопряженной реакции уреаза/глутаматдегидрогеназа, выполненная в кинетическом варианте, может использоваться для определения содержания мочевины в моче при нормальном уровне аммиака, поскольку эндогенный аммиак в моче быстро используется в начале реакции. Последующее изменение поглощения при 340 нм обусловлено образованием аммиака в уреазной реакции.

В другой ферментной системе аммиак, образующийся на первом этапе при участии уреазы, реагирует с глутаматом при участии аденозинтрифосфата (ATФ) в присутствии глутаминсинтетазы. Аденозиндифосфат (АДФ), образующийся в этой ферментативной реакции, определяют с использованием пируваткиназы и пируватоксидазы с образованием перекиси водорода. На заключительном этапе в реакции между пероксидом, фенолом и 4-аминоантипирином при участии фермента пероксидазы образуется окрашенный комплекс. Величину его поглощения оценивают фотометрически.

Был предложен ферментативный метод, основанный на использовании фермента лейциндегидрогеназы, позволяющий избежать вмешательства в реакцию эндогенного аммония. Метод основан на использовании фермента лейциндегидрогеназы, связывающей ионы NH4+ в реакции с образованием L-изолейцина после гидролиза мочевины при участии уреазы. Метод проводят в два этапа.

Первый этап — связывание эндогенного NH4+ . NH4+, содержащийся в исследуемом образце (сыворотка крови или моча), реагирует с 2-кетоизокапроновой кислотой в присутствии НАДН₂ и лейциндегидрогеназы с образованием L-изолейцина.

Второй этап. Определение концентрации NH4+ проводят с помощью той же реакции после добавления в среду инкубации фермента уреазы.

Для определения малых количеств мочевины в биологических жидкостях и микродиализатах был предложен кинетический люминометрический метод. Метод основан на использовании уреазы, расщепляющей мочевину в АТФ-зависимой реакции. Данный фермент катализирует две последовательно протекающие реакции: биотин-зависимое карбоксилирование мочевины (реакция 1) и гидролиз аллофаната, образующегося в первой реакции (реакция 2). Скорость гидролиза АТФ контролируют с помощью люминометра в люциферин-люциферазной реакции. Скорость гидролиза ATФ пропорциональна содержанию мочевины в исследуемом образце. Подобный подход использовался для контроля в реальном времени эффективности гемодиализа.

Потенциометрические методы определения мочевины

Широко используются электрохимические методы определения мочевины. В этой группе методов скорость реакции оценивают по изменению электропроводности среды в ходе реакции гидролиза мочевины уреазой. Образующийся в уреазной реакции CO2 и аммиак увеличивают электропроводность реакционной смеси. При кинетическом способе анализа можно анализировать и сыворотку крови, и образцы мочи.

Для регистрации скорости уреазной реакции в некоторых анализаторах используют ион-селективные электроды. В потенциометрическом методе используют аммоний-селективный электрод c иммобилизированной уреазой. Этот принцип был использован в различных анализаторах.

Потенциометрические методы определения мочевины экономичны, точны и быстры, однако требуют специального оборудования (ион-селективного анализатора или блока).

Методы определения мочевины с использованием технологии «сухой химии»

Данные методы определения концентрации мочевины в сыворотке крови заключаются в использовании реакции между аммиаком и pH-индикатором. Этот подход использован в технологии «сухой химии» в виде тест-полосок с последующей визуальной оценкой результатов с помощью отражательной фотометрии.

Образующийся на первом этапе аммиак диффундирует через полупроницаемый слой тест-полоски и реагирует с pH-индикатором, вызывая окрашивание сенсорной зоны.

Считается, что методы с использованием технологии «сухой химии» обладают высокой точностью, поскольку не испытывают существенных вмешательств со стороны посторонних соединений. Основное неудобство этих методов — их «закрытость», т. е. строгая адаптированность к определенным анализаторам.

Для современной автоматизированной лаборатории предпочтительнее использовать или электрохимический метод, или метод с ферментными системами типа уреаза/ГлДГ в кинетическом варианте, поскольку эти методы более специфичны, высокопроизводительны и точнее всех других. Они легко адаптируются к широкому диапазону анализаторов и по этой причине должны оставаться методами выбора.

Литература:

• Слепышева В. В., Балябина М. Д., Козлов А. В. - Методы определения мочевины
• Справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под редакцией Меньшикова В. В. - Москва, "Медицина", 1987 г.